Fotografia científica: microscopia eletrônica

Há diversas técnicas que compõe a Fotografia. Uma que admiro e pratico constantemente é a fotomacrografia (ou macrofotografia). Esta é considerada a fotografia dos pequenos seres e objetos e, por isso, muito utilizada na pesquisa e no ensino de ciências.

Uma fotografia macro é aquela cuja relação entre o tamanho da imagem capturada e o do assunto fotografado apresenta uma proporção de 1:1 até 10:1; ou seja, a imagem capturada varia do mesmo tamanho a dez vezes o tamanho do assunto fotografado. Essa proporção é calculada pela equação:

Onde, A (ampliação) se refere à razão entre C (tamanho da imagem capturada) e R (tamanho real do assunto).

Para imagens capturadas com dimensões superiores a 10 vezes o tamanho do assunto fotografado, entramos no campo da microfotografia. É desse ponto em diante que começam os registros de temática química. Na verdade, a maior parte dos registros dessa natureza se encontra muito além desse ponto, pois os átomos têm a ordem de grandeza do Angström (10^-10 m).

Um Angström [Å] é a décima bilionésima parte de um metro.

Registros próximos a essa ordem só podem ser obtidos por meio de microscópios eletrônicos, como o apresentado na Figura 1.

A origem da microscopia eletrônica remonta 9 de março de 1931, quando o físico alemão Ernst Ruska (1906 – 1988) e seus colaboradores apresentaram o primeiro microscópio eletrônico de transmissão. A repercussão desse aparelho foi tão longeva que 55 anos depois (1986) Ruska recebeu o Prêmio Nobel de Física.

Nenhuma outra ferramenta de pesquisa experimentou tão rápido avanço, em toda a história da ciência, quanto os microscópios eletrônicos de transmissão e de varredura (SANTOS, 1996; apud SANCHES, 2007). Após 1931, foram desenvolvidos novos equipamentos para a microscopia eletrônica que permitiram uma profusão de técnicas. Atualmente são utilizados diferentes métodos de interação eletrônica com a matéria. Na microscopia eletrônica de transmissão são utilizados feixes de elétrons transmitidos e difratados; enquanto na microscopia eletrônica de varredura elétrons secundários e os refletidos são detectados em função da posição de um feixe primário.

O aprimoramento das técnicas de preparação de amostras também auxiliou a capacidade de observação de estruturas celulares e da própria estrutura da matéria. A microscopia eletrônica definiu nossa concepção morfológica de determinados organismos e da composição da matéria.

O princípio da microscopia eletrônica está baseado na incidência de um feixe de elétrons na superfície de uma amostra previamente preparada. Na varredura eletrônica, o feixe primário de elétrons interage com a amostra e perde energia por dispersão e absorção. A interação desse feixe de elétrons com a amostra produz a emissão de um feixe secundário de elétrons que, ao ser transcodificado, produz um registro digital. Na transmissão eletrônica, o feixe de elétrons emitido em direção à amostra interage com ela enquanto a atravessa. A interação dos elétrons transmitidos através da amostra forma um registro digital.

Portanto, em ambos os casos, o que observamos não é a imagem da amostra produzida pela reflexão da luz incidente, como ocorre na microscopia óptica, mas o resultado da interação entre um feixe de elétrons e a estrutura atômica da amostra. Por meio dessa interação, pode-se construir a topografia da superfície da amostra. As Figuras 2 e 3 são exemplos de imagens obtidas por microscopia eletrônica.

É possível ver ou fotografar o átomo?

Em minhas aulas de Química Geral, na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), frequentemente escuto a pergunta: “é possível ver ou fotografar o átomo?”. Aliás, a ideia de que seja possível obtermos imagens de um átomo com auxílio de microscópios eletrônicos é corroborada por muitos veículos de comunicação.

Para efeito desse artigo, vamos definir o verbo “ver” como a “percepção da visão”. Enxergamos algo quando raios de luz incidentes sobre um assunto são refletidos até a nossa retina, onde a imagem é formada (Figura 4), convertidos em impulsos elétricos, que serão transmitidos ao cérebro pelo nervo óptico.

Quando um assunto é muito pequeno, a quantidade de luz que ele reflete também é pequena e insuficiente para estimular a nossa retina. Para resolver essa limitação da nossa visão, foram desenvolvidos equipamentos que amplificam o sinal luminoso emitido pelo assunto. Entretanto, no universo submicroscópico os assuntos são tão pequenos que passamos a falar em resolução de imagem.

Figura 4: Representação de um olho humano. A fisiologia do olho humano para a formação da imagem se assemelha ao mecanismo de funcionamento de uma câmera fotográfica para a captação de fotografias. Ilustração: André Bianco

Resolução de imagem descreve o nível de detalhe que uma imagem comporta. Resoluções altas significam mais detalhes na imagem. Resoluções baixas, menos detalhe. A ausência de resolução representa indefinição da imagem.

O limite de resolução de uma imagem se encontra exatamente na distância entre duas ondas (λ) do espectro luminoso (Figura 5). Se o assunto for inferior ao comprimento de onda da luz, não será possível obter resolução para ele e, portanto, ele não poderá ser definido.

Figura 5: O poder de resolução de um instrumento óptico é sua capacidade de separar as imagens de dois pontos mais próximo possível um do outro, em um objeto estudado com a luz de comprimento de onda λ. Na imagem da esquerda conseguimos perceber os detalhes do assunto; na da direita, a baixa resolução de imagem une os três círculos e impede que percebamos o verdadeiro formato do assunto. Ilustração: André Bianco

A visão humana é uma das mais sofisticadas dentre todos os animais, entretanto, ela possui a limitação de formar imagens em nossas retinas apenas com o espectro luminoso visível (Figura 6). Quando uma onda eletromagnética tem comprimento inferior ou superior ao do espectro visível, nosso aparelho óptico é incapaz de vê-la. Assim, os assuntos que vemos têm dimensões suficientes para refletir luz com comprimento de onda entre 4.000 e 7.000 Å. No entanto, átomos têm dimensões da ordem de 1 Å e, portanto, são cerca de 4.000 a 7.000 vezes menores do que o comprimento de onda do espectro visível. Isso posto, se tentarmos obter a imagem de um átomo pela incidência de luz, não será possível obter resolução de imagem. Conclusão, o átomo não é visível por esse método!

Figura 6: Espectro visível da luz. Ondas eletromagnéticas com comprimento de onda menor que 4.000 Å (ultravioleta) ou maiores que 7.000 Å (infravermelho) não são visíveis ao olho humano.

O que pode ser feito para vislumbrarmos a elegância do universo submicroscópico é estimularmos eletricamente a superfície de um material e registrarmos a resposta dessa superfície ao estímulo elétrico; como é feito na microscopia de tunelamento. Um resultado desse estímulo é observado na Figura 7, no qual podemos observar uma amostra de grafite com resolução atômica.

Figura 7: Estudo da superfície do grafite. As regiões claras, em formato circular, são a resposta dos átomos de carbono do grafite ao estímulo elétrico do microscópio de tunelamento (Fonte: Laboratório de Filmes Finos – IFUSP). Coloração artificial obtida por meio de software de edição de imagens.

O que vemos na Figura 7 não é a fotografia de átomos de carbono. O resultado está mais para a área ocupada por esses átomos e que pode ser registrada pela interação átomo a átomo da superfície do material com o feixe de elétrons incidido sobre ela. Em outras palavras, é como se a superfície do material estivesse coberta por um véu e o que vemos é o volume dos átomos abaixo desse véu.

Além disso, qualquer imagem obtida por microscopia eletrônica não terá cores, pois as cores de uma imagem são resultado da reflexão de ondas de diferentes comprimentos do espectro visível. Como as imagens obtidas em microscopia eletrônica não são resultado da reflexão da luz, não tem sentido falarmos nas cores da amostra. As cores são adicionadas com o uso de softwares de edição de imagens e representam cores fantasias.

Agradecimentos

Agradeço a Profa. Dra. Maria Cecília Barbosa da Silveira Salvadori (Professora Associada do IFUSP), coordenadora do Laboratório de Filmes Finos do Instituto de Física da Universidade de São Paulo, Brasil, pelas imagens cedidas para a ilustração de conteúdos desse artigo.

Referências Bibliográficas

LABORATÓRIO DE FILMES FINOS. Disponível em: http://fap.if.usp.br/. Último acesso: 9 jun 2016.

SANCHES, J. DURIGAN, J.F. SANTOS, J.M. dos. Revista Brasileira de Fruticultura. V. 29, n. 1, p. 57-60, 2007.

SANTOS, J.M. dos. Microscopia eletrônica de varredura aplicada às ciências biológicas. Jaboticabal: FUNEP, 1996. 56p.